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          Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒 分子生物試劑

          • 更新時間:  2023-07-27
          • 產品型號:  80234
          • 簡單描述
          • Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒
            從福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片中同時純化基因組DNA和總RNA(包括小RNAs)

            使用小樣本量即可獲得大量純化產物
            在純化同時,保持DNA和RNA的完整性
            高效分離RNA和DNA
            對同一FFPE樣本進行全面的DNA和RNA分析
          詳細介紹

          Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒



          如要對基因組學和轉錄組學數據進行可靠比較,則需從同一樣本中純化DNA和RNA。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit使用的溶解方法,從福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣本中純化DNA和RNA。純化產物適用于real-time PCR和焦磷酸測序等應用。

          從FFPE樣本中純化DNA和RNA。

          [A] 從多個大鼠FFPE組織樣本中純化基因組DNA并儲存于室溫。使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(專用于從FFPE樣本中純化DNA的試劑盒,作為對照)進行純化,兩種試劑盒都含有RNase消化試劑。采用吸光度測定方法檢測每個20 μm組織切片的DNA產量。[B] 從多個大鼠FFPE組織樣本中純化RNA并儲存于室溫。使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或RNeasy FFPE Tissue Kit(專用于從FFPE樣本中純化DNA的試劑盒,作為對照)進行純化。采用吸光度測定方法檢測每個10 μm組織切片的RNA產量。從FFPE組織中純化DNA或RNA時,AllPrep Kit的表現與專用的純化試劑盒表現相當。

          對預擴增的cDNA進行芯片分析。

          使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit從人類乳腺FFPE組織中純化總RNA。然后使用RT2 FFPE PreAMP技術進行逆轉錄。使用Human Cell Cycle RT2 Profiler PCR Array,通過real-time PCR進行基因表達分析,將腫瘤樣本與非腫瘤樣本進行對比。ΔΔCT分析顯示:腫瘤樣本中的基因表達與非腫瘤樣本的基因表達存在x倍的差異。

          對FFPE樣本中的DNA和RNA進行可靠擴增。

          使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或專用于從FFPE樣本中純化DNA或RNA的試劑盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 或RNeasy FFPE Kit,作為對照)從大鼠FFPE組織中純化獲得[A] DNA 和[B]、[C] RNA。在ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System上,使用[A] QuantiTect SYBR® Green PCR Kit對78 bp的Prnp基因擴增子進行Real-time PCR分析,或是用[B]、[C] QuantiTect SYBR® Green RT-PCR Kit對Jun原癌基因表達進行real-time RT-PCR分析。AllPrep Kit和另外兩個專用試劑盒的CT值相當,表明三種試劑盒純化DNA或RNA的效率相當。[C] 此外,在沒有逆轉錄酶(–RT)的條件下分析了Jun基因的表達。脾臟是富含DNA的組織,其擴增曲線平坦,說明純化的RNA中不含基因組DNA。

          AllPrep DNARNA FFPE樣本純化步驟。


          Qiagen AllprepFFPE DNA/RNA Kit(50)試劑盒


          性能
          使用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit純化的DNA和RNA的質量與使用QIAamp FFPE Tissue Kit和RNeasy FFPE Kit/miRNeasy FFPE Kit純化的產物的質量相當。因此,純化產物可用于焦磷酸測序、real-time PCR和RT-PCR等下游應用。
          原理

          AllPrep DNA/RNA FFPE Kit專為從FFPE樣本中同時純化基因組DNA和總RNA而設計。該試劑盒可使用同一樣本純化DNA和RNA,而非像其他純化方法那樣,需將樣本分為兩份再分別進行純化操作。如將樣本分為兩份分別純化DNA和RNA,其純化出的DNA和RNA來自不同的細胞群落,可能具有不同性質特征。從同一樣本中同時純化DNA和RNA可減少浪費,因為FFPE樣本是十分珍貴的樣本,通常很難恢復且樣本量少。

          由于固定和包埋,FFPE樣本中的核酸通常都嚴重片段化,核酸的分子量通常小于從新鮮或冷凍樣本中分離出的核酸的分子量。從同一FFPE樣本中分離DNA和RNA面臨著很大困難:片段化的DNA長度短,且部分是單鏈結構;因此其更像RNA,而非完整的DNA。片段化DNA這一特性使得用物理方法分離DNA和RNA十分困難。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit使用的溶解方法,從同一個FFPE樣本中分別釋放DNA和RNA。

          盡管標準的質量控制分析(如凝膠電泳或芯片分析方法)無法檢測到甲醛的化學修飾,但其對酶分析有嚴重干擾。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit已經過優化,可zui大程度上逆轉甲醛化學修飾,而不引起DNA和RNA的進一步降解。

          操作流程
          簡單的流程可從同一個樣本中純化高品質DNA和RNA。AllPrep DNA/RNA FFPE Kit使用的溶解方法,從同一個FFPE樣本中分別釋放DNA和RNA。使用這種方法時,FFPE樣本要在優化的裂解緩沖液中孵育,使得RNA釋放出來,而DNA形成沉淀。離心后,將含有RNA的上清和含有DNA的沉淀分別處理,純化RNA和DNA。再次進行孵育有一定的解交聯作用,然后使用RNeasy MinElute或QIAamp MinElute離心柱純化RNA和DNA。用柱上DNA酶處理純化的RNA,以有效去除DNA污染。根據RNA與離心柱的結合情況,純化的RNA中可能含有也可能不含miRNA等小RNAs。對于純化后的DNA,可選擇性進行柱上RNA酶消化,因為在離心前的DNA和RNA分離步驟中RNA污染水平已達到zui低。
          應用

          盡管AllPrep DNA/RNA FFPE Kit已經過優化,可zui大程度上逆轉福爾馬林化學修飾,而不引起DNA和RNA的進一步降解;但從FFPE樣本中純化獲得的核酸不應該用于需要大分子量DNA或完整長度RNA的下游應用。一些應用可能需要進行化學修飾后,再使用片段化核酸(如:設計PCR和RT-PCR的小擴增子)。在cDNA合成中,應使用基因特異性引物,而非oligo-dT引物。如果無法使用基因特異性引物,則可使用任意引物。

          特點
          參數
          ApplicationsPCR, qPCR, real-time RT-PCR, microarray
          Elution volumeRNA: 14-30µl ; DNA: 30-100µl
          FormatSpin column
          Main sample typeFFPE tissue samples
          Number of preps per run50
          ProcessingManual (centrifugation)
          Purification of total RNA, miRNA, poly A+ mRNA, DNA or proteinRNA (miRNA) and DNA
          Sample amountmax. 4*10 µm sections or 2*20 µm sections
          TechnologySilica technology
          Time per run or per prep6h for 10 samples, including sectioning
          YieldVaries




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